Ru（II）復(fù)合物的凋亡活性的試驗(yàn)樣本評(píng)估

作者：李勇 北京市朝陽(yáng)區(qū)六里屯社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(北京城建老年病醫(yī)院)

對(duì)Ru（II）配合物與BSA進(jìn)行了電子吸收和熒光發(fā)射光譜研究與DNA結(jié)合方法相似，只是使用BSA代替CT-DNA。
抗菌和抗氧化評(píng)價(jià)采用3種革蘭氏陰性（大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌）和3種革蘭氏陽(yáng)性（黃體微球菌、枯草芽孢桿菌和巨芽孢桿菌）采用良好擴(kuò)散法對(duì)所有合成的化合物進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，將大約20 mL的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入經(jīng)過(guò)消毒過(guò)的培養(yǎng)皿中。細(xì)菌試驗(yàn)菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24 h。采用各細(xì)菌微生物培養(yǎng)50 μL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（1×105 CFU/mL）制備細(xì)菌草坪。用消毒的不銹鋼軟木鉆制備了直徑為5毫米的瓊脂孔。將所有化合物溶解在DMSO中，得到1 mg/mL的原液。每個(gè)孔裝載100 μL，二甲亞砜（DMSO）為陰性對(duì)照，鏈霉素（DMSO中的100μg）為陽(yáng)性對(duì)照。將培養(yǎng)皿在37°C下孵育24小時(shí)，并檢查是否存在抑制區(qū)。測(cè)量抑制區(qū)直徑，記錄每個(gè)生物體的平均值，并以毫米為單位表示。采用肉湯稀釋法測(cè)定MIC（最低抑菌濃度）。
DPPH清除%eT?Ao樣本=Ao100，其中Ao是對(duì)照反應(yīng)的吸光度，樣本是樣品的吸光度?？箟难岜徽J(rèn)為是其已知的抗氧化活性的陽(yáng)性對(duì)照，也被平行測(cè)試。MTT測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)-二甲基噻唑）二苯基四唑溴化銨測(cè)定程序采用。將細(xì)胞放置于96孔微檢測(cè)培養(yǎng)板中（每孔8×103個(gè)細(xì)胞），在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。將配合物在DMSO中溶解，用RPMI 1640稀釋?zhuān)尤肟字?，最終濃度在10?6~10?4m之間。添加培養(yǎng)基（100 μL）制備對(duì)照孔。用含有不含細(xì)胞的培養(yǎng)基的孔作為空白孔。培養(yǎng)皿在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中以37°C孵育48小時(shí)。孵育完成后，在每孔中加入原液MTT染料溶液（20 μL，5 mg/mL）。4h后，加入含有N、N-二甲基甲酰胺（50 %）和十二烷基硫酸鈉（20 %）的緩沖液（100 μL），使MTT甲瓚溶解。然后在微孔板分光光度計(jì)上在490 nm波長(zhǎng)上測(cè)量每個(gè)孔的光密度。半抑制濃度值是通過(guò)繪制復(fù)雜濃度的存活百分比圖并讀取50 %細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照存活的濃度來(lái)確定的。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，以得到平均值。HeLa腫瘤細(xì)胞系為本研究的研究對(duì)象。
為了評(píng)估Ru（II）復(fù)合物的凋亡活性，將HeLa Cells 1×106培養(yǎng)，用Ru（II）復(fù)合物以半抑制濃度劑量處理24小時(shí)，4°C離心。然后用1 mL冰PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）洗滌細(xì)胞2次，洗滌2 min。微球在500 μL的HEPES（4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸）結(jié)合緩沖液中重懸，并在4°C下洗滌5 min。將細(xì)胞重懸于70 μL的HEPES結(jié)合緩沖液中，加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V，室溫黑暗下孵育15 min。在室溫黑暗孵育后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
細(xì)胞周期阻滯吖啶橙是一種核酸選擇性異色染色劑，可用于細(xì)胞周期的測(cè)定。在PBS中調(diào)整濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)的細(xì)胞懸液。加入緩沖液I（20 mM檸檬酸-磷酸鹽，1 mM EDTA，0.2蔗糖，0.1 % Triton X-100）0.5 mL，4°C，攪拌懸浮并孵育10 min。加入緩沖液II（10 mM檸檬酸磷酸，0.1 M氯化鈉），AO 0.5 mL，4°C，攪拌懸浮。HeLa細(xì)胞用釕配合物處理，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
分子對(duì)接研究分子對(duì)接用于預(yù)測(cè)兩個(gè)分子之間形成的分子間復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。將小分子與大分子對(duì)接是一項(xiàng)復(fù)雜而困難的任務(wù)。Accelry的發(fā)現(xiàn)工作室軟件在本研究中用于設(shè)計(jì)鉛分子和估計(jì)藥物和蛋白質(zhì)結(jié)合復(fù)合物的對(duì)接相互作用，配體與靶標(biāo)形成的鍵的數(shù)量。對(duì)于受體配體相互作用，本研究使用了發(fā)現(xiàn)工作室的LibDock模塊，LibDock是一種將配體到受體活性結(jié)合位點(diǎn)的高通量算法，也是一種站點(diǎn)特征對(duì)接算法。在運(yùn)行LibDock之前，將配體和蛋白質(zhì)原子應(yīng)用于CHARMM力場(chǎng)。人類(lèi)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1受體下載自RCSB PDB（PDB ID-1T8I）的晶體結(jié)構(gòu)；利用發(fā)現(xiàn)工作室去除蛋白質(zhì)的所有水分子，穩(wěn)定電荷，填充缺失的殘基，生成側(cè)鏈。該受體應(yīng)具有生物活性和穩(wěn)定狀態(tài)。受體建成后，應(yīng)確定受體內(nèi)的活性位點(diǎn)。受體可能有許多活性位點(diǎn)，但應(yīng)該選擇感興趣之一。釕配合物用工具繪制草圖，并用于對(duì)接到目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)。研究了具有較高的得分的結(jié)果姿態(tài)，并檢測(cè)了相互作用的配體目標(biāo)復(fù)合物。在虛擬篩選的過(guò)程中，利用評(píng)分函數(shù)來(lái)估計(jì)配體結(jié)合的親和力，以篩選出活性和非活性化合物。